這種細(xì)胞保持著其原始的生物學(xué)特性,，具有高度的活性和分裂能力。原代細(xì)胞在許多生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要地位,，包括藥物篩選,、疾病模型的建立以及疫苗研發(fā)等,。原代細(xì)胞的獲得通常是通過(guò)組織剪切、消化或酶解等方式從機(jī)體或組織中分離出來(lái),。這些細(xì)胞脫離了它們?cè)谏矬w中的環(huán)境,，但是仍然保持著其基本的生物學(xué)特性，包括細(xì)胞膜,、細(xì)胞核,、細(xì)胞器以及其他重要的生物分子。原代細(xì)胞在未經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)的情況下,，保持著其原始的生物學(xué)特性,，因此，它們常常被用于藥物篩選,、毒理學(xué)研究等,。同時(shí)，由于原代細(xì)胞具有高度活性和分裂能力，它們也被用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)中,，如皮膚移植,、骨頭修復(fù)和神經(jīng)再生等。此外,，原代細(xì)胞模型在疾病研究中也扮演著重要角色。由于原代細(xì)胞具有更高的生物真實(shí)性,，使用它們建立的疾病模型能夠更準(zhǔn)確地模擬疾病的發(fā)展過(guò)程和藥物的作用機(jī)制,，從而為新藥研發(fā)和疾病治、療提供更有效的工具,?？傊?xì)胞是一種具有高度活性和分裂能力的細(xì)胞,，在生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要的作用,。由于其原始的生物學(xué)特性。細(xì)胞污染的處理的技術(shù),。黑龍江豚鼠科研技術(shù)服務(wù)技術(shù)

外泌體作為藥物載體由于特殊的結(jié)構(gòu)和循環(huán)方式,，外泌體作為藥物運(yùn)輸?shù)妮d體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。例如外泌體的尺寸分布能夠增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng),，從而有選擇性地深入組織;其外層磷脂雙分子層可以保護(hù)內(nèi)容物不受各種生物酶的影響,，維持各種生物分子的活性;外泌體普遍存在于各種體液和組織中，其體積小,，結(jié)構(gòu),、組成與細(xì)胞膜類(lèi)似，導(dǎo)致外泌體可以在避開(kāi)免疫系統(tǒng)監(jiān)督的同時(shí)深入組織內(nèi)部,，有較好的生物相容性;當(dāng)采用內(nèi)源外泌體時(shí),，能明顯降低其他藥物載體可能引起的有害免疫反應(yīng);除此之外，某些細(xì)胞來(lái)源或經(jīng)特殊修飾過(guò)的外泌體具有良好的特異性,，可以與特定的或組織結(jié)合,。因此，載藥成為外泌體研究的一個(gè)重要分支,，具有良好的應(yīng)用前景,。在外泌體中引入藥物的方式包括體內(nèi)裝載和體外裝載兩種。體內(nèi)藥物裝載可以通過(guò)傳統(tǒng)方法(如病毒轉(zhuǎn)染,、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔等)轉(zhuǎn)染來(lái)源細(xì)胞,，編碼感興趣的RNA或蛋白質(zhì)，也可以使藥物與來(lái)源細(xì)胞共混,，使細(xì)胞分泌產(chǎn)生含有目標(biāo)生物分子的外泌體,。體外藥物裝載則首先需要得到純化的外泌體，然后將感興趣的藥物通過(guò)電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法裝入純化的外泌體。外泌體內(nèi)可裝載的藥物包括小分子化學(xué)藥物,、蛋白質(zhì)和多肽,、核酸藥物、天然產(chǎn)物等,。天津疾病科研技術(shù)服務(wù)構(gòu)建通過(guò)對(duì)動(dòng)物模型的研究,，科研人員可以更清楚地了解疾病的發(fā)展過(guò)程和機(jī)制，為人類(lèi)疾病的檢查提供理論依據(jù),。

建議按照2×106每孔的數(shù)量將293T細(xì)胞均勻鋪入,。(2)第二天：在24小時(shí)之內(nèi)，觀察293T細(xì)胞的匯合度在90%~95%之間時(shí),，向其中加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體,，DNA-脂質(zhì)體復(fù)合體制備方法如下：a)輕輕混勻LipoMax，根據(jù)說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)量于500μlOpti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基中,，混合均勻并置于室溫5分鐘,。b)在500μlOpti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基中稀釋DNA，總質(zhì)量為15μg按照載體質(zhì)粒:psPAX2:=4:3:1的比例加入DNA,。c)將稀釋后的LipoMax和稀釋后的DNA輕輕混勻,，常溫靜置20分鐘，形成DNA-LipoMax復(fù)合體,。(3)將DNA-LipoMax復(fù)合體輕柔地滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，輕輕搖晃培養(yǎng)皿混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。(4)病毒收集濃縮病毒：加入DNA-LipoMax復(fù)合體48小時(shí)后,，收集病毒上清，同時(shí)加入10ml預(yù)溫的293T培養(yǎng)基到細(xì)胞培養(yǎng)皿中,。將收集到的病毒上清存在4℃冰箱中;收集72小時(shí)病毒上清,，與48小時(shí)病毒上清混在一起。將離心機(jī)溫度降溫到4℃,，600g,，離心5分鐘，去除其中的細(xì)胞碎片,，上清液經(jīng)μm濾頭過(guò)濾,，加入病毒濃縮液，配制濃縮病毒液,。將濃縮后的病毒放于4℃冰箱搖床上,，旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。第二天,，4度離心機(jī),，3000~4000g離心15分鐘,。棄掉上清液，加入1Xpbs或培養(yǎng)基重懸,。

靜置25分鐘后把酒精倒干,，用吸水紙吸出多余的酒精，然后配壓縮膠,，同樣的操作,，關(guān)鍵是梳子要插得快，要小心梳子下產(chǎn)生氣泡,，然后靜置30分鐘,。如果是當(dāng)天跑膠，我會(huì)等上層膠凝2個(gè)小時(shí)再用,，但要注意防干燥縮水，可以在一個(gè)小時(shí)的時(shí)候沿著梳子上緣加點(diǎn)電泳液,。所以我一般提前一晚制膠,，泡于純水或者電泳液里置于4度冰箱暫存。三,、蛋白電泳1,、上樣前準(zhǔn)備把膠組裝到電泳芯上，注意密閉性(否則漏液),，如果內(nèi)槽漏液就不是勻強(qiáng)電場(chǎng)了,，條帶可能就不是一條直線。然后內(nèi)槽倒?jié)M電泳液,，拔梳子,，這一步要小心，梳子要兩邊一起緩緩?fù)习纬?，然后觀察泳道內(nèi)有無(wú)脫落的膠?；蛘吣z絲，有的話用1毫升注射器吸出,。然后從冰箱取出蛋白樣品,，解凍。準(zhǔn)備振蕩器,。2,、上樣和電泳注意，上樣后蛋白會(huì)開(kāi)始慢慢在膠中彌散,，所以上樣越快越好,。我習(xí)慣先上蛋白Marker,再上蛋白樣品，蛋白上樣前確保樣品完全解凍和充分振蕩(推薦使用振蕩器振蕩),，吸的時(shí)候沒(méi)有拉絲即可,，建議上樣分鐘把樣品從冰上取出來(lái),，不然樣品中SDS可能會(huì)結(jié)晶析出，從而影響電泳效果,。上層膠80V25分鐘,，下層膠120V65分鐘。四,、轉(zhuǎn)膜1,、轉(zhuǎn)膜前準(zhǔn)備我會(huì)在電泳結(jié)束0分鐘準(zhǔn)備，把轉(zhuǎn)膜液配好置于4度冰箱預(yù)冷,，然后裁膜,，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜裝置。干貨分享 | 避坑,，微生物培養(yǎng)的污染因素及預(yù)防方法,，少走彎路。

3）基因/蛋白質(zhì)表達(dá)定性或定量檢測(cè)在進(jìn)行分子檢測(cè)的過(guò)程中,，保持核酸和蛋白質(zhì)的完整性至關(guān)重要,，因此在取樣過(guò)程中，應(yīng)盡量避免核酸及蛋白質(zhì)的降解,。如不注意采樣過(guò)程,，將會(huì)導(dǎo)致樣本中的核酸及蛋白質(zhì)的無(wú)差別降解，嚴(yán)重影響后續(xù)分子檢測(cè)結(jié)果,。在條件允許的情況下,，樣本在離體后應(yīng)立刻裝入凍存管內(nèi)，并立即放入液氮中進(jìn)行冷凍,。在RNA提取樣本的保存過(guò)程中,，可以選擇非冷凍型RNA保存液或Trizol試劑進(jìn)行RNA酶的。針對(duì)蛋白質(zhì)提取樣本的保存,，我們同樣可以使用商品化的蛋白酶劑進(jìn)行短期處理,。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChnReaction，PCR）及免印跡（Westernblotting,，WB）,，這兩種實(shí)驗(yàn)手段是分子學(xué)檢測(cè)中不可或缺的一部分，也是發(fā)表至關(guān)重要的分子檢測(cè)數(shù)據(jù),。PCR主要用來(lái)對(duì)基因在基因組層面或轉(zhuǎn)錄層面的變化進(jìn)行定性或定量檢測(cè),，而WB則主要用來(lái)對(duì)某一蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)。（4）轉(zhuǎn)錄組學(xué),、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)檢測(cè)隨著檢測(cè)水平及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,，各類(lèi)組學(xué)檢測(cè)的價(jià)格降低，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中也常常運(yùn)用組學(xué)檢測(cè)來(lái)提升實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的檔次,。在我們進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)過(guò)程中,，同樣是要首先確保目標(biāo)RNA或蛋白質(zhì)的片段完整性,。常用于研究細(xì)胞的成瘤能力、細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,、細(xì)胞的耐藥和靶分子對(duì)腫瘤細(xì)胞的發(fā)展的影響等等,。浙江兔科研技術(shù)服務(wù)購(gòu)買(mǎi)

純干貨Western blot （WB）條帶灰度統(tǒng)計(jì)與GraphPad作圖.黑龍江豚鼠科研技術(shù)服務(wù)技術(shù)

RNA各種可逆的化學(xué)修飾被認(rèn)為是一種新的表觀遺傳調(diào)控方式。m6A是真核生物mRNA常見(jiàn)的化學(xué)修飾,，在調(diào)控mRNA穩(wěn)定性,，剪切和翻譯方面具有重要的作用。作者使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了METTL3（甲基轉(zhuǎn)移酶3）,，一種主要的RNAN6-腺苷-甲基轉(zhuǎn)移酶,，在人肝細(xì)胞（HCC）和多種實(shí)體中高表達(dá)。在臨床上,，METTL3的過(guò)度表達(dá)與肝細(xì)胞患者不良預(yù)有關(guān),。體外實(shí)驗(yàn)證明敲除METTL3會(huì)抑制HCC細(xì)胞增殖，遷移及克隆形成,。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明敲除METTL3會(huì)明顯抑制HCC體內(nèi)成瘤和肺轉(zhuǎn)移,。另外，使用CRISPR/dCas9-VP64系統(tǒng),，內(nèi)源性高表達(dá)METTL3會(huì)促進(jìn)HCC細(xì)胞在體外和體內(nèi)生長(zhǎng)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,、m6A-Seq,、MeRIP-PCR，作者確定了SOCS2（細(xì)胞因子信號(hào)2的抑制因子）作為METTL3介導(dǎo)的m6A修飾的下游靶基因,。敲除METTL3表達(dá)會(huì)消除SOCS2mRNAm6A修飾并增強(qiáng)SOCS2mRNA表達(dá),。m6A介導(dǎo)的SOCS2mRNA降解是依賴于m6A“讀取器”蛋白YTHDF2?？傊?，METTL3在HCC大部分高表達(dá)中,并通過(guò)m6A-YTHDF2依賴機(jī)制抑制SOCS2表達(dá)從而促進(jìn)HCC進(jìn)展。因此,，作者發(fā)現(xiàn)了在肝發(fā)生過(guò)程中表觀遺傳改變的一種新機(jī)制,。圖4RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶METLLT3在肝組織中高表達(dá)。黑龍江豚鼠科研技術(shù)服務(wù)技術(shù)

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